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歐億特攜手馬爾文帕納科為藥物篩選按下快進鍵！
利用生物物理片段篩選“甜蜜點”
發(fā)現(xiàn)抑制BRPF1 的新化學型
馬爾文帕納科為藥物篩選按下快進鍵！
基于化合物庫的有效采樣是片段篩選命中 (fragment screening hit) 識別范式的核心。通常片段分子越小，采樣效率越高。對于小分子和靶蛋白之間弱結(jié)合力的檢測能力決定了片段分子可以設(shè)計的大小。
CLS獨特的片段篩選平臺
馬爾文帕納科旗下 Concept Life Sciences 和 Creoptix 聯(lián)手開發(fā)了一個獨特的片段篩選平臺。該平臺將專門構(gòu)建的片段分子庫與的光柵耦合干涉 (GCI) 技術(shù)相結(jié)合，通過在生物物理“甜蜜點” (Sweet Spot) 進行篩選操作，可在幾天內(nèi)確定有效的片段命中 (fragment hits)，從而為片段命中優(yōu)化提供理想的起點，并為候選藥物提名提供了更快的途徑。
本文報告了使用該平臺進行片段分子篩選，并識別了能有效結(jié)合 BRPF1 溴結(jié)構(gòu)域的新片段。
BRPF1
Bromodomains 溴結(jié)構(gòu)域是進化上保守的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用模塊，可識別組蛋白乙?；嚢彼?。溴結(jié)構(gòu)域和 PHD 指蛋白 1 (BRPF1) 是單核細胞白血病鋅指 (MOZ) 組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的亞基。它通過多個表觀遺傳閱讀器結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，包括獨特的雙 PHD 和鋅指組裝、溴結(jié)構(gòu)域和 C 末端 PWWP 結(jié)構(gòu)域（如圖 1所示）。
BRPF1 被認為是肝細胞癌[1]和急性髓細胞白血病[2]的靶點，目前這種侵襲性癌癥的成人 5 年生存率不到 30%[3]。
圖 1. MOZ/MORF 組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物介導(dǎo) H3K9、H3K14 和 H3K23 乙?；约せ罨?。BRPF1 包含兩個植物同源域 (PHD) 手指的乙酰閱讀器結(jié)構(gòu)域，它們由一個鋅指節(jié) (PZP 結(jié)構(gòu)域)、一個溴結(jié)構(gòu)域和一個脯氨酸-色氨酸-色氨酸-脯氨酸 (PWWP) 結(jié)構(gòu)域隔開。
近年來報道了一系列 BRPF1 抑制劑，包括 GSK6853[4]和 NI-57 [5]（圖 2）。高通量片段對接 [6] 和基于配體的篩選 [7] 也被用于鑒定其他化學型 ，并在 X 射線結(jié)構(gòu)的輔助下對其進行優(yōu)化（圖 2）。但是目前尚未有選擇性的 BRPF1 抑制劑進入臨床研究，所以能抑制這一靶點的新化學型仍是研究熱點。
圖 2. 左：選擇性 BRPF1 抑制劑的化學結(jié)構(gòu)。右圖：BRPF1與片段分子結(jié)合的 X 射線結(jié)構(gòu) (pdb = 5EQ1)。BRPF1 以綠色帶狀表示，其表面由位于?；Y(jié)合域的殘基側(cè)鏈構(gòu)成碳原子為綠色，氧原子為紅色，氮原子為藍色。片段分子以棒狀表示。
生物物理“甜蜜點”
Sweet Spot
據(jù)文獻估計，化學宇宙已經(jīng)由多達 11 個重原子、1420 萬個化合物增長到了多達 17 個重原子、超過 1660 億個化合物[8]。這種指數(shù)增長體現(xiàn)了片段分子大小的增加對化學領(lǐng)域的影響，而片段庫的過分龐雜并不利于基于片段的藥物設(shè)計 (FBDD) （圖 3）。伴隨著FBDD的發(fā)展，涌現(xiàn)出了多種生物物理技術(shù)能夠檢測到片段分子與靶點之間微弱的結(jié)合。因此，一個有效的篩選活動應(yīng)能在篩選化合物時，可以限度的在生物物理技術(shù)可以檢測到的極限范圍內(nèi)進行采樣，即片段分子的生物物理“甜蜜點”（圖 3）。
圖 3. 化學宇宙的演變（橙色）、找到篩選命中的機會（灰色）和典型的親和力（藍色）與重原子數(shù)量的關(guān)系。雖然典型的商業(yè)片段庫（紫色）傾向于集合較大的化合物，但通過高靈敏的生物物理技術(shù)，在生物物理“甜蜜點”（綠色）范圍內(nèi)，可以對更小的片段分子進行更有效的篩選。
生物物理片段庫構(gòu)建
圖 4. 片段庫構(gòu)建流程：從 55,000 個 CLS 化合物集合到終 1,133 個選定片段。該過程包括一個生物物理 MPO 對匹配生物物理“甜蜜點”的片段進行分類，以限度地提高多樣性，并基于溶解度和純度對化合物質(zhì)量進行嚴格過濾和篩選。
化合物的多樣性
圖 5.（A）CLS化合物庫的主要成分分析。散點之間間隔越遠，相應(yīng)片段的結(jié)構(gòu)越多樣化（顏色對應(yīng)于簇 #），（B）慣性矩陣圖表示 CLS 片段分子的桿狀、片狀和球形形狀（顏色對應(yīng)于簇 #），（C ) 結(jié)構(gòu)多樣性由在不同 Tanimoto 指數(shù)下屬于 1 到 5 個簇的化合物數(shù)量表示，(D) 1,133 個 CLS 片段的每個主要chemical handles的百分比。
片段命中類庫
Fragment Hit-Like Library
在過去 20 年的 FBDD 研究中，已報告的片段命中 [9] 和商業(yè)片段集合的物理化學特征之間出現(xiàn)了明顯的二分法，這通常由 3 規(guī)則 (Ro3) [10] （圖 6） 支持 。
通過瞄準生物物理“甜蜜點”，CLS 生物物理片段集合（圖 6）不僅可以有效地對可用的化合物庫進行采樣，而且還顯示了與報告的片段命中非常匹配的物理化學特征。
圖 6. Giordanetto 等人報道的 486 個片段命中的物理化學特征[9]（綠色）、典型的商業(yè)片段集合（橙色，從 11 家供應(yīng)商的 120,000 多個片段中收集）和Concept Life Sciences構(gòu)建的生物物理片段集合（藍色）。
生物物理篩選
圖 7. SPR 和 GCI 篩選工作流程。GCI 技術(shù)使用Creoptix WAVE delta 系統(tǒng)（圖片），該系統(tǒng)可實現(xiàn)簡單且省時的片段篩選。
使用 waveRAPID?
進行動力學篩選
Creoptix WAVE Delta
GCI 分子間相互作用分析儀
這是一種測量動力學的新方法， 不依賴于梯度濃度滴定。waveRAPID?脈沖式注入單一濃度樣品，通過增加樣品在傳感器表面的滯留時間，即可從單個樣品孔中獲得動力學（圖 8）。由于 GCI 的高靈敏度，片段命中可以根據(jù)更豐富的數(shù)據(jù)進行排名，并根據(jù)動力學速率常數(shù)而不是單獨的親和力來選擇命中。
圖 8. 傳統(tǒng)動力學檢測與 waveRAPID? 比較。在典型的配體結(jié)合分析中（左），分析物以增加的濃度加入，每次注入的持續(xù)時間一致。在waveRAPID ?分析中（右），該系列由一個循環(huán)組成，其中只有一個被解離部分中斷的結(jié)合階段和一個終解離階段。模型擬合用解離階段來完成。
實驗設(shè)計和初步篩選數(shù)據(jù)
基于動力學速率常數(shù)擬合、Rmax 和 KD 的命中選擇
使用 2 個傳感器芯片、1100 個移液器吸頭、4 個樣品板和 2.1L 緩沖液，運行時間為 54 小時，可提供完整的動力學信息。
圖 9：waveRAPID? 實驗結(jié)果。(A) 在基于GCI技術(shù)的 WAVE delta 4 個不同通道上設(shè)置的實驗設(shè)計。(B) 使用 WAVE control工作站 的 Direct Kinetics 引擎（黑色）將waveRAPID? 傳感圖（紅色）擬合到一對一綁定模型的示例，并提供 Rmax、ka（結(jié)合速率）、kd（解離速率）和 KD（ 解離平衡常數(shù)）。(C) 生成的 waveRAPID? 速率圖，顯示每個片段結(jié)合劑的 kd vs ka（顏色為 kd ）。產(chǎn)生的 KD 范圍用虛線突出顯示。
參考文獻：
(1) Cheng, C.LH., et. al. Bromodomain-containing protein BRPF1 is a therapeutic target for liver cancer. Commun. Biol. 4, 888 (2021)
(2) Shima, H., et. al. Bromodomain-PHD finger protein 1 is critical for leukemogenesis associated with MOZ-TIF2 fusion. Int J Hematol. 99, 21-31 (2014).
(3) https://www.cancerresearchuk.org/about-cancer/acute-myeloid-leukaemia-aml
(4) Bramborough, P., et. al. GSK6853, a Chemical Probe for Inhibition of the BRPF1 Bromodomain. ACS Med. Chem. Lett. 7, 6, 552–557 (2016)
(5) Igoe, N., et. al. Design of a Biased Potent Small Molecule Inhibitor of the Bromodomain and PHD Finger-Containing (BRPF) Proteins Suitable for Cellular and in Vivo Studies. J. Med. Chem. 60, 2, 668–680 (2017)
(6) Zhu, J., et. al. Twenty Crystal Structures of Bromodomain and PHD Finger Containing Protein 1 (BRPF1)/Ligand Complexes Reveal Conserved Binding Motifs and Rare Interactions. J. Med. Chem. 59, 11, 5555–5561 (2016)
(7) Zhu, J., et. al. Structure-based discovery of selective BRPF1 bromodomain inhibitors. Eur. J. Med. Chem. 155, 337-352 (2018)
(8) Ruddigkeit, L., et. al. Enumeration of 166 billion organic small molecules in the chemical universe database GDB-17. J. Chem. Inf. Model., 26, 52, 2864-75 (2012)
(9) Giordanetto, F., et. al. Fragment Hits: What do They Look Like and How do They Bind? J. Med. Chem. 62, 3381?3394 (2019)
(10) Congreve, M., et. al. A 'Rule of Three' for fragment-based lead discovery. Drug Discov. Today 8, 876–877 (2003
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關(guān)于歐億特
蘇州歐億特儀器科技有限公司是一家專業(yè)為實驗室提供整體解決方案的銷售與服務(wù)公司，主要致力于為客戶提供實驗室各種基礎(chǔ)設(shè)備以及大型色譜、質(zhì)譜分析儀器，產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于生物制藥、化工、電子、食品、環(huán)境、以及單位和高?？蒲性核阮I(lǐng)域。公司目前代理產(chǎn)品有：瑞士梅特勒-托利多METTLER-TOLEDO（實驗室天平、pH計、電導(dǎo)率儀、溶解氧儀、電位滴定儀、水分儀、密度折光儀等）、法國SUZE（TOC總有機碳分析儀）、法國伊拉勃Erlab（實驗室無管道通風過濾系統(tǒng)）、德國美墨爾特Memmert（實驗室溫控箱體）、德國布魯克Bruker（傅里葉紅外和拉曼光譜儀）、美國康寧（微通道反應(yīng)器）、馬爾文帕納科（Creoptix分子互作儀）。我們?yōu)槊總€產(chǎn)品配備單獨的技術(shù)支持和售后人員，為客戶提供：維修、培訓、安裝、3Q認證等一站式服務(wù)。
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