現(xiàn)代生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)等研究中，隨著功能基因組研究的深入，生物大小分子的生物學(xué)功能研究占據(jù)著非常重要的地位；生物大小分子的相互作用分析成為目前分子功能學(xué)研究中不可缺少的重要手段，因此一個好的分子互作研究工具，無疑將對我們的科研起到極大的促進作用。目前研究分子互作的檢測技術(shù)層出不窮，從傳統(tǒng)的終點法ELISA、Co-IP 、Western Blot雜交檢測到近年迅速火熱的實時無標(biāo)記的分子互作系統(tǒng)。無標(biāo)記技術(shù)通常將蛋白質(zhì)受體分子固定在傳感器表面，然后注入配體（稱為分析物）使其流過傳感器。在特定的締合時間后（由受體結(jié)合位點的飽和度決定），將不包含配體的溶液通過流通池注入以解離受體-配體復(fù)合物。受體和配體的結(jié)合和解離的變化將轉(zhuǎn)化為光的干涉圖案。這些變化基于與表面受體與配體分子結(jié)合的數(shù)量，并以傳感圖表示，從中可以計算出動力學(xué)締合常數(shù)（kon）和解離常數(shù)（koff），以及Kd（圖1）

                             圖1

相對其他只能做出終點檢測的如Pull-down檢測技術(shù)，無標(biāo)記技術(shù)讓研究者可以定量分析生物分子間的相互作用 Kon, Koff 和KD值，對分子間相互作用研究提供了更深入的分析。因此，無標(biāo)記技術(shù)在生命科學(xué)研究中的作用越來越重要，且在很多醫(yī)藥及醫(yī)學(xué)研究中頗受關(guān)注。那么今天推薦給大家的就是基于GCI（Grating-Coupled Interferometry光柵耦合干涉）技術(shù)原理的一款設(shè)備WAVE delta，現(xiàn)在就帶大家來了解這款性價比超高的黑馬設(shè)備。

技術(shù)原理

與經(jīng)典的SPR技術(shù)相比，GCI巧妙的利用波導(dǎo)技術(shù)的原理，將光路延伸至整個傳感器表面。如圖2，當(dāng)配體（分析物）與固定在傳感器表面的受體蛋白相互作用時，漸逝場會經(jīng)歷特征性的相位延遲，將參考波和檢測光波耦合到同一波導(dǎo)中干涉并產(chǎn)生信號^[1]，從而消除了由光學(xué)器件的熱/機械位移引起的漂移,GCI技術(shù)極大地提高了檢測信號的穩(wěn)定性，且每個漸逝波都探測到了表面的相互作用，該技術(shù)已經(jīng)由Creoptix AG（瑞士）開發(fā)。圖3，SPR技術(shù)中的每個漸逝波通常覆蓋約100 nm直徑的表面積，而GCI中的漸逝波覆蓋整個傳感器表面約2 mm長度，從而探測出比SPR更多的相互作用^[2]。GCI儀器的高靈敏度使它們能夠以低響應(yīng)的解析動力學(xué)，從而使研究人員能夠研究分子量比非常大（例如，數(shù)百個kDa固定的配體與200 Da的小分子分析物）分子之間的結(jié)合相互作用?？梢詼y定低活性的配體和低密度的表面受體，與SPR Biocore儀器不同，由Creoptix AG設(shè)計的GCI在實際設(shè)備中既沒有微流體通道也沒有微閥。而是將微流體內(nèi)置到一次性芯片中。這使得GCI能夠檢測粗樣品（例如，細(xì)胞培養(yǎng)基，未純化的細(xì)胞裂解物，脂質(zhì)囊泡等），并通過光學(xué)生物傳感器（可檢測親和力從低pM到數(shù)十mM）擴展動力學(xué)的測量范圍。

技術(shù)特點

1.無與倫比的靈敏度

對于無標(biāo)記技術(shù)，展現(xiàn)靈敏度的方式是看信號強度，而信號強度取決于配體和分析物的分子量比以及配體的固定水平。當(dāng)配體和分析物的分子量比超過300時，無論如何提高配體固定水平，傳統(tǒng)的無標(biāo)記技術(shù)由于器原理的局限性都無法檢測到分子間的相互作用，而GCI憑借其超高的靈敏度可以在不僅在分子量比大于300的正常固定水平下可以得到穩(wěn)定的信號，且在配體低固定水平也能夠準(zhǔn)確表征其動力學(xué)信息。

圖4

如圖4，配體和分析物的分子量比為370，（圖4左）配體固定水平為2775pg/mm² (1pg/mm²=1RU),1：1結(jié)合的理論信號強度為7.5（理論值=1/分子量比*固定水平），實得信號值約為5.而傳統(tǒng)的SPR技術(shù)無法表征分子量比超過300的動力學(xué)信息。這還不是GCI的極限，繼續(xù)減少配體固定水平（圖4右）到835RU，可以看到即使信號強度低于1個RU，GCI得到的信息依然準(zhǔn)確，表現(xiàn)出GCI超高的靈敏度與強大的穩(wěn)定性。

繼續(xù)增加分子量比直至1000?。▓D5），GCI依然可以表征其動力學(xué)！

圖5

2.超高時間分辨率

相比于傳統(tǒng)的終點法ELISA、Co-IP 、Western Blot，無標(biāo)記技術(shù)不僅可以檢測KD，更重要的是可以給研究者提供動力學(xué)信息（結(jié)合和解離常數(shù)），而解離常數(shù)更是其重中之重。但對于一些（快上快下）的分子間動力學(xué)過程，其解離常數(shù)小于1s^-1，現(xiàn)有的無標(biāo)記技術(shù)很難準(zhǔn)確表征，而GCI技術(shù)目前可以檢測0.1s內(nèi)分子間作用變化，表征解離速率小于10s^-1的分子間相互作用。如圖6

圖6

3.創(chuàng)新性的芯片設(shè)計（維護成本極低）

   目前市場的主流的SPR品牌Biacore，光路系統(tǒng)相對復(fù)雜，維護成本比較高（單是流路管堵塞就需花費十幾萬元每年，而流路管道又特別細(xì)稍微粘稠樣本就容易堵塞），儀器操作復(fù)雜且價格較高，需要專人保養(yǎng)。而Creoptix不僅創(chuàng)新性的提高的靈敏度和時間分辨率，且創(chuàng)新性的將微流路外置在芯片中，無需定期更換微流路，日常維護每年僅消耗100mL的PBS，支持全血清，全血漿檢測，無需擔(dān)心堵塞！兼容48，96，384板任意組合，120h無人值守運行。

4.更廣泛的應(yīng)用范圍

得益于WAVE delta的靈敏度，時間分辨率和微流路外置的創(chuàng)新性提升，使科學(xué)家們可以做以前做不到的事情，看到以前到不到的信息。

圖7：固定膜蛋白（整個膜）的動力學(xué)表征

圖8：VLPs的動力學(xué)表征（無需反轉(zhuǎn)配體和樣品）

圖9：ADA定量（檢測下限極低）

WAVE delta的應(yīng)用范圍和相關(guān)參數(shù)

分析領(lǐng)域 : 分子相互作用模式的研究；動力學(xué)常數(shù)的測定；親和常數(shù)測定，濃度的測量及構(gòu)象變化的速率等。 生命科學(xué)研究領(lǐng)域 : 蛋白質(zhì)組學(xué)研究、癌癥研究、新藥研發(fā)、信號傳遞、分子識別、熱力學(xué)分析、免疫調(diào)節(jié)、免疫測定、疫苗開發(fā)、瞬時結(jié)合、配體垂釣、結(jié)合特異性、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及酶反應(yīng)等。分析樣品類型 ：小分子化合物、多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、寡聚糖到類脂、脂質(zhì)體，噬菌體、病毒樣顆粒和細(xì)胞等。

參數(shù)配置

流通池（通道）數(shù)量： 4

噪聲(RMS)<0.01 pg/mm ² （1 pg/mm ²=1RU）

漂移 <0.3 pg/mm ² /min

讀取頻率 ：1 Hz, 10 Hz or 40 Hz

分子量：無限制

結(jié)合常數(shù)范圍： ka = 10 ³ —10 ⁷ M ^-1 s ^-1

解離常數(shù)范圍： kd = 10 ^-5—10 s ^-1

溫控范圍 WAVEdelta: 4°C - 45°C (max 20°C below ambient)   

微流路：整合到芯片中

脫氣裝置：內(nèi)置

流速： 0—400ml/min

樣品容量：兩塊48(96,384)孔板

自動化：120h無人值守運行

進樣量：20-425uL（普遍100ul）

緩沖液：自動轉(zhuǎn)換 4 buffers

參考文獻：

[1] Pedro J.S(2020)In vitro analytical approaches to study plant ligand-receptor interactions. American Society of Plant Biologists. 2:1687-1712

[2] Lukosz W (1991) Principles and sensitivities of integrated optical and surface plasmon sensors for direct affinity sensing and immunosensing. Biosens Bioelectron 6: 215–225